兵庫県と神戸大学大学院医学研究科附属感染症センター臨床ウイルス学分野の森康子教授らの研究グループは、金博宝188,金博宝188体育（SARS-CoV-2）のオミクロンBA.5を含む様々な変異株に対して有効なユニバーサル中和抗体^{※1, 2}を獲得しました。

金博宝188,金博宝188体育感染症（COVID-19）^※3の初期に流行した欧州株（D614G株）に感染歴があり、金博宝188,金博宝188体育mRNAワクチンを2回接種した人の血液から、抗体の情報を持つ免疫細胞を一細胞ずつ分離し、それぞれ抗体遺伝子を取得しました。それらの候補についてSARS-CoV-2スパイク抗原に対する結合力を基準に選択し、10種のヒトモノクローナル抗体^※4を作製しました。

10種の抗体について、D614G、デルタ株、そしてオミクロンBA.1株に対する中和抗体価を調べた結果、3つの抗体が中和活性を有することがわかり、MO1、MO2、MO3と命名しました。それらについてD614G、デルタ株、オミクロンBA.1株、BA.2株、BA.5株のスパイクタンパク質^※5への結合能を調べた結果、MO1は全ての変異株のスパイクタンパク質に結合しました。またMO2はBA.5株以外の全てのスパイク抗原に結合し、MO3はデルタ株、BA.5株以外の全てのスパイク抗原に結合しました。

MO1、MO2、MO3、各抗体の中和活性を定量的に評価するために、D614Ｇ、デルタ株、オミクロンBA.1株、BA.1.1株、BA.2株、BA.5株のウイルスを用いてプラーク減少中和試験^※6によって50％阻害濃度（50% Inhibition Concentration: IC₅₀）^※7を測定した結果、MO1は全ての変異株に対してIC₅₀ 25 ng/ml以下の高い中和活性を示しました。MO2はBA.5株以外のすべての変異株に対して、MO3はデルタ株、BA.5株以外の変異株に対して中和活性を示しました。またMO1、MO2、MO3はオミクロンBA.2.75株にも中和活性を示しました。

MO1、MO2についてバイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry : BLI）^※8によってBA.2株に由来するスパイク抗原の受容体結合ドメインとの分子間相互作用の強さを評価した結果、MO1はBA.2株に由来するスパイク抗原の受容体結合ドメインに高い親和性で結合し、またBA.5株に由来するスパイク抗原に対しても高い親和性を維持していることが示されました。

MO1がスパイクタンパク質に結合する様式をクライオ電子顕微鏡^※9によって解析し、その結合様式を明らかにしました。MO1はオミクロンでも変異が起こっていない部位を中心に結合しており、MO1が幅広い変異株に対しても中和活性を持つ仕組みが明らかになりました。

今回見出されたヒトモノクローナル抗体MO1は、初期のD614Gやデルタ株を中和出来るだけでなく、オミクロンBA.1株、BA.1.1株、BA.2株といった日本で流行したウイルスも効果がありました。さらに、免疫回避能が特に高いことが知られ世界中に広まっているオミクロンBA.5株、BA.2.75株のような新規のウイルスにも効果を示したことから、様々な変異株に有効な新規ユニバーサル中和抗体として抗体医薬への応用が期待できます。

この研究成果は「bioRxiv」にオンライン掲載されました。

＊注：本研究は専門家による査読前のため、内容が変更される可能性があります。金博宝188,金博宝188体育関連論文は査読前にpreprintとして*bioRxiv*等に登録、公開されるよう推奨されています。

ポイント

• 金博宝188,金博宝188体育感染症（COVID-19）を引き起こす金博宝188,金博宝188体育（SARS-CoV-2）は感染性が高く、様々な変異株が世界中で広がってきました。
• 特に2021年11月に初めて報告されたオミクロンBA.1株、BA.2株は、日本を含め全世界中に流行が拡大し、その派生として更なる変異株が出現し続けています。
• これらの新たな変異株では感染に重要なスパイクタンパク質に30か所以上の変異が起こっており、従来の抗体医薬に対して抵抗性を持つことが報告されています。
• 一方で3回目ワクチン接種を受けた人はオミクロンBA.1株に対しても有効な抗体を多く持っていることがあり、本研究では、そういったヒト免疫細胞の中から、幅広い変異株にも有効性を示す中和抗体の遺伝子を探索しました。
• 作製された10種のヒトモノクローナル抗体の中で、MO1、MO2、MO3と名付けた3種がオミクロンBA.1株に対して中和活性を示しました。
• MO1はD614G、デルタ株、オミクロンBA.1株、BA.2株、BA.5株に由来するスパイクタンパク質へ結合能を示し、MO2はBA.5株を除くすべて、MO3はデルタ株とBA.5株を除くすべてに結合しました。
• プラーク減少中和試験ではMO1がD614G、デルタ株、オミクロンBA.1株、BA.1.1株、BA.2株、BA.5株に対し高い中和活性を持つことが示されました。MO2はBA.5株を除くすべてに、MO3はデルタ株とBA.5株を除くすべてに中和活性を示しました。
• MO1、MO2、MO3は、新たな変異を持つとされるオミクロンBA.2.75株に対しても中和活性を示しました。
• MO1、MO2はBA.2株のスパイクタンパク質中の受容体結合ドメインに高い親和性で結合し、さらにMO1はBA.5株の受容体結合ドメインにも高い親和性を持っていました。
• クライオ電子顕微鏡によってMO1がスパイクタンパク質に結合する様式を解析した結果、MO1はオミクロンでも変異が起こっていない部位を中心に結合していることが示されました。
• 以上の結果から、ヒトモノクローナル抗体MO1が、現在世界中で流行しているオミクロンBA.5株を含む幅広いウイルスに中和活性を持つユニバーサル中和抗体であることが示され、新規の抗体医薬候補として期待されます。

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研究の背景

金博宝188,金博宝188体育 (SARS-CoV-2) による金博宝188,金博宝188体育感染症 (COVID-19) の流行は2022年10月現在も世界中で続いており、これまでに累計で6億2000万人以上が感染したと報告されています。この流行を抑制するためワクチン接種が世界中で行われ、また抗体医薬による治療法も確立されてきましたが、様々な変異株ウイルスの発生により、こういったワクチンや抗体医薬の有効性の低下が懸念されてきました。特に2021年11月に起こったオミクロンBA.1株の発生は大きな転機であり、日本でも2022年1月から第6波となる爆発的な感染拡大を引き起こしました。その後もオミクロンBA.1.1株や、BA.2株が流行し、さらに2022年7月以降はBA.5株による第7波が発生しています。BA.5株は日本のみならず世界中で大流行しており、多くのウイルスがその派生による変異株であると言われています。またインドを中心にBA.2.75 (通称ケンタウロス) と呼ばれる変異株も出現しました。

オミクロンBA.1株等の新たな変異株では、SARS-CoV-2の感染において重要な働きを持つスパイクタンパク質の中に30か所を超える変異が生じており、このことが従来のSARS-CoV-2を標的とした抗体医薬の効果を弱め、ワクチンや感染によって誘導された免疫からの回避に寄与すると考えられています。新たに発生し続けるSARS-CoV-2の変異株の流行を抑制するためには、これらの新規変異株に有効な中和抗体の解析が重要であり、そういった抗体の中から特に有効性の高いものとして得られるモノクローナル抗体は新規抗体医薬の候補となると考えられます。

我々はこれまでにも兵庫県との連携によって金博宝188,金博宝188体育に感染した患者さんやワクチン接種者の血清中の抗体を調査してきました。兵庫県立加古川医療センターとの共同研究として行った調査では、感染から回復後に二回mRNAワクチンを接種した患者さんで、オミクロンBA.1株に対しても有効な抗体が多く産生されていることを発見し、国際学術誌に報告しました (倉橋、森、他 Journal of Infectious Diseases 2022年10月)。これらの患者さんはパンデミック初期に流行したD614Gに感染し、武漢株を基にしたmRNAワクチンを2回接種したとこで、遺伝子に多くの変異を持つオミクロンBA.1株に対しても有効な抗体が産生されていることわかりました。つまり、武漢株と多くの変異を有するオミクロンで共通した抗原部位を認識する中和抗体が産生されているということになります。

そこで、そういった背景を持った患者さんの免疫細胞から抗体遺伝子を取得することで、従来の変異株とオミクロン発生後の新規変異株に共通して中和活性を有するユニバーサル中和抗体の新規作製を試みました。

研究の内容

先行研究において、BA.1株を含む様々な変異株に対して高い中和抗体価を示した3名の血液から末梢血単核球を分離し、抗体遺伝子の探索を行いました。国内iBody社への委託により、抗体遺伝子を記憶しているメモリーB細胞^※10を取得し、スパイク抗原へ反応する抗体を産生しているものを選抜しました (図1)。それらの細胞一つずつから抗体遺伝子を増幅し、10種のヒトモノクローナル抗体を作製しました。

10種のヒトモノクローナル抗体のうち、オミクロンBA.1株に中和活性のあるモノクローナル抗体3種 (MO1、MO2、MO3) が見出されましたので、さらなる詳細な解析を行いました。パンデミックの初期に流行したD614G、デルタ株、オミクロンBA.1株、BA.2株、そしてBA.5株の変異をそれぞれ導入したスパイクタンパク質を作製し、MO1、MO2、MO3の結合能を調べました (図2)。その結果、MO1はすべての変異株に由来するスパイクタンパク質に対して結合することが示されました。MO2はBA.5株以外のすべてに結合し、またMO3はデルタ株およびBA.5株以外のすべてに結合しました。

各ヒトモノクローナル抗体の中和活性を定量的に評価するために、D614G、デルタ株、オミクロンBA.1株、BA.1.1株、BA.2株、そしてBA.5株のウイルスを用いてプラーク減少中和試験 (Plaque reduction neutralization test: PRNT) を実施し、50%阻害濃度 (50% Inhibition Concentration: IC₅₀) を算出しました (図3、表１)。その結果、MO1はすべての変異株に対してIC₅₀ 25 ng/ml以下の高い中和活性を示しました。MO2はBA.5株以外のすべてのウイルスに中和活性を示し、またMO3はデルタ株およびBA.5株以外のすべてに中和活性を示しました (BA.1.1株については未実施)。また同様の試験をBA.2.75株に対して実施したところ、MO1、MO2、MO3のすべてで抗体による中和活性が確認できました。

これらのヒトモノクローナル抗体がスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン (Receptor Binding Domain: RBD) に対し、分子としてどの程度の強さで結合するかを調べるために、バイオレイヤー干渉法による解析を行いました。その結果、BA.2株の変異を持ったスパイクタンパク質受容体結合ドメインに対してMO1は解離定数^※11 3.3 nM、MO2は2.0 nMという抗体として十分な結合強度を有していることが示されました。またMO1はBA.5株の変異を持ったスパイクタンパク質受容体結合ドメインに対しても十分な強度で結合し、解離定数は11nMでした。

ヒトモノクローナル抗体MO1が実際にどのようにスパイクタンパク質に結合しているかを調べるために、高輝度光科学研究センターとの共同研究でクライオ電子顕微鏡による解析を行いました。その結果、オミクロンBA.1株の変異を持つスパイクタンパク質とMO1の結合状態を原子レベルの分解能で解明することができました (図４)。

その結果、MO1はスパイクタンパク質RBDの中でも、オミクロンBA.5株やBA.2.75株を含め、これまでに流行してきた変異株では変異していない部分を中心に結合していることが明らかとなりました。このことはMO1が示した幅広い変異株に対する中和活性を説明できる結果です。MO1と似た部位に結合する抗体は既存の抗体医薬に使われているものを含め、いくつか報告がありますが、MO1と一致するものはなく、MO1は独自の性質によってSARS-CoV-2を認識し、その中和を引き起こしていると考えられます。

今後の展開

この研究では、SARS-CoV-2の新規変異株にも有効なヒトモノクローナル抗体の作製を行い、MO1、MO2、MO3と言った3種の候補を見出しました。中でもMO1は過去に日本で流行したD614G、デルタ株、オミクロンBA.1株、BA.1.1株、そして現在問題になっているBA.5株およびBA.2.75株のすべてに対して高い中和活性を示し、幅広いSARS-CoV-2変異株に対して有効なユニバーサル中和抗体として、抗体医薬への応用が期待できます。現在、MO1がウイルスの中和を引き起こす詳細なメカニズムの解析を行うと同時に、実際の生体内でもSARS-CoV-2のウイルス感染を阻止できるかについて動物実験により有効性の解析を実施しており、オミクロンBA.5株やBA.2.75株、そして今後発生が予想される新規SARS-CoV-2変異株に対しても有効な抗体医薬としての臨床応用を目指しています。

用語解説

※１　抗体

病原体に対抗して体内で作られるタンパク質で、いわゆる“免疫”として、感染症から免れるために貢献します。一般的に、病原体に感染後しばらく経ってから作られ、ある程度の期間持続すると考えられています。このため、抗体があれば、かつてその病原体に感染したことがあることを示唆します。また、ワクチンによって人為的に抗体を誘導することで、新たなウイルスの感染や病態発現を抑制することが可能です。

※２　中和抗体

体内に侵入したウイルスを攻撃し、不活化する能力のある抗体。ウイルスを排除し、感染を防ぐための役割も担っていると考えられています。

※３　COVID-19

いわゆる金博宝188,金博宝188体育感染症。金博宝188,金博宝188体育（SARS-CoV-2）によって引き起こされ、一般的には飛沫感染や接触感染で感染すると考えられています。

※４　モノクローナル抗体

抗体を産生するB細胞は、クローンと呼ばれる系統ごとに独自の抗体遺伝子を持っており、それぞれ性質の異なる抗体を産生します。体内ではそういった系統の異なる多数の種類のB細胞が生まれることで、様々な性質を持った抗体が産生されますが、モノクローナル抗体は様々な手法によりそういった一種のB細胞がもつ独自の抗体を単離したものを意味し、一般的に抗体医薬としてはモノクローナル抗体として得られたものが使用されます。

※５　スパイクタンパク質

金博宝188,金博宝188体育（SARS-CoV-2）のウイルス粒子に存在する突起を構成し、標的細胞への結合を担っています。スパイクタンパク質に対する抗体は、ウイルスによる細胞侵入を阻害し得るため、mRNAワクチンは、スパイクタンパク質を体内で発現するように設計されています。またSARS-CoV-2変異株はこのスパイクタンパク質の中に変異を持つことで抗体から逃れていることも報告されています。

※６　プラーク減少中和試験（Plaque reduction neutralization test: PRNT）

SARS-CoV-2は細胞に感染した後に周囲の細胞に伝播して細胞溶解を引き起こすことで、プラークと呼ばれる肉眼でも観察可能な痕跡を残すため、その数を計測することで感染の状況を把握できます。プラーク減少中和試験ではこのことを利用し、ある濃度の抗体をウイルスに添加した時に、どれだけプラークの数が減少したかを調べることで、抗体の中和活性を調べることができます。

※７　50%阻害濃度（50% Inhibition Concentration: IC₅₀）

プラーク減少中和試験において、抗体を添加しない条件に比べて50%のプラーク数に抑えるために必要な抗体濃度を表します。抗体の中和活性を定量的に評価することができ、小さい値であるほど低濃度でもウイルスの感染抑止効果が高いことを意味しますので、中和活性が高いと言えます。

※８　バイオレイヤー干渉法

分子間の相互作用の強さを計測する方法のひとつで、光学センサーの表面にある分子を設置し、もう一方の分子溶液に浸して測定を行います。溶液中の分子がセンサー上の分子へ結合したときに生じる光干渉を計測し、リアルタイムで結合の様子を捉えることができます。対象分子溶液と洗浄液に浸したときに、それぞれ結合速度と解離速度が計測でき、速く結合する分子、遅く解離する分子ほど相互作用が強いことになります。

※９　クライオ電子顕微鏡解析

分子の立体構造を解明する方法のひとつで、極低温下で電子線によって様々な方向を向いた分子の形を電子線透過像として撮影し、莫大な数の像を総合的に解釈することで、三次元の立体構造を明らかにすることができます。近年の高度なクライオ電子顕微鏡解析では分子を構成するそれぞれの原子の位置関係を見分けられるほどの高分解能で立体構造決定が可能です。

※10　メモリーB細胞

病原体への感染やワクチン接種によって、それらに対応した抗体を産生する様々なB細胞が体内で生まれます。それらのB細胞は時間経過とともに体内で減少しますが、一部はメモリーB細胞として体内に維持され、再度感染やワクチン接種を受けた際に再び抗体を産生するように応答します。これらのメモリーB細胞は細胞ごとに異なる抗体遺伝子を持っていますので、一つずつの細胞を分離することで、様々な抗体遺伝子を得ることができます。

※11　解離定数

2種類の相互作用する分子が溶液中にあるとき、十分な時間が経過した後の平衡状態では、それらが結合した複合体の濃度と、それぞれが単独として残っている分子の濃度が一定の比率になる事が知られています。解離定数はこの比率を表す数字で、小さい値になるほど結合が強いことになります。解離定数は分子同士が結合する速度と解離する速度の比率と一致することから、バイオレイヤー干渉法ではそれらの速度を計測することで解離定数としいて分子間の結合の強さを決定することができます。

謝辞

本研究は兵庫県からの支援を受けて実施されました。またクライオ電子顕微鏡解析については国立研究開発法人日本医療研究開発機構　生命科学?創薬研究支援基盤事業 (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research: BINDS) の支援を受けて実施されました (課題番号JP22ama121001)。

論文情報

タイトル

“Novel monoclonal antibodies showing broad neutralizing activity for SARS-CoV-2 variants including Omicrons BA.5 and BA.2.75”

DOI

10.1101/2022.09.02.506305

著者

Hanako Ishimaru¹, Mitsuhiro Nishimura¹, Lidya Handayani Tjan¹, Silvia Sutandhio¹, Maria Istiqomah Marini¹, Gema Barlian Effendi¹, Hideki Shigematsu², Koji Kato², Natsumi Hasegawa¹, Kaito Aoki¹, Yukiya Kurahashi¹, Koichi Furukawa¹, Mai Shinohara¹, Tomoka Nakamura¹, Jun Arii¹, Tatsuya Nagano³, Sachiko Nakamura⁴, Shigeru Sano⁵, Sachiyo Iwata⁶, Yasuko Mori¹

1. 神戸大学大学院医学研究科　附属感染症センター　臨床ウイルス学分野
2. 公益財団法人　高輝度光科学研究センター　構造生物学推進室
3. 神戸大学大学院医学研究科　内科学講座?呼吸器内科学分野
4. 兵庫県立加古川医療センター 総合内科
5. 兵庫県立加古川医療センター 救命救急センター
6. 兵庫県立加古川医療センター 循環器内科

掲載誌

bioRxiv

関連リンク

• 医学研究科附属感染症センター 臨床ウイルス学